2013执业药师药物分析：高效液相色谱法

　　高效液相色谱法

　　一、基本原理

　　1.基本概念

　　色谱峰参数：峰高或峰面积(用于定量)，峰位(保留值表示，用于定性)，峰宽(用于衡量柱效)

　　保留值：保留时间、死时间、调整保留时间

　　峰宽：标准差、半峰宽、峰宽

　　2.塔板理论：把组分在两相间的连续转移过程，分解为间歇的在单个塔板中的分配平衡过程

　　理论塔板数 n=5.54(tR/Wh/2)2

　　色谱柱的理论塔板数越多，柱效越高;同样长度中塔板高度越小，柱效越高。

　　3.速率理论：主要说明使色谱峰扩张而降低柱效的因素

　　范氏方程 H=A+B/μ+Cμ

　　A为涡流扩散项。采用适当粒度、均匀的填料并填充均匀可减小涡流扩散

　　B为纵向扩散系数。流动相为液体，柱温为室温，B/μ可忽略不计

　　C为传质阻抗系数。在能完全覆盖载体表面的前提下，应适当减少固定液用量。

　　二、高效液相色谱仪

　　1.高压输液泵

　　2.色谱柱：分析型和制备型

　　3.进样阀

　　4.检测器

　　(1)选择性检测器：与待测物浓度、结构有关

　　①紫外检测器：灵敏度、重复性及线性范围较好，适用于具有共轭结构的化合物的检测

　　②光二极管阵列检测器：检测原理相同，可同时记录待测物吸收光谱，用于光谱鉴定和纯度检查

　　③荧光检测器：灵敏，用于在流动相条件下具有荧光或经衍生转化为具有荧光的化合物的检测

　　④电化学检测器：灵敏度高，仅用于在流动相条件下发生氧化-还原反应的化合物

　　⑤质谱检测器：高灵敏度、高选择性、分析范围广;不适用于小分子化合物，主要用于大分子物质如蛋白质、多肽的检测

　　(2)通用性检测器：质量型检测器

　　①示差折光检测器：仅对少数物质如糖类灵敏度较高，受环境温度影响大，实际应用少

　　②蒸发光散射检测器：适用于UV检测困难的物质的分析，响应值与浓度通常不呈线性关系。

　　三、吸附色谱法

　　1.原理：被分离组分与流动相对吸附剂吸附能力的差异

　　2.常用固定相和流动相

　　固定相：硅胶、氧化铝、高分子多孔微

　　流动相：烷烃加极性调节剂;极性越强，洗脱能力越强

　　四、分配色谱法

　　1.原理：被分离组分溶入互不相溶的固定相与流动相，达到平衡后浓度之比(分配系数)的差异

　　正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性。极性小的组分先流出，极性大的组分后流出。用于分离极性及中等极性物质

　　反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性。极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。应用广泛，用于分离非极性至中等极性物质

　　离子对反相色谱：在流动相中加入有机离子对试剂，用于有机酸、碱、盐的分离

　　离子抑制色谱：调整流动相pH，抑制组分的解离

　　2.常用固定相和流动相

　　(1)固定相：化学键合相

　　非极性：十八烷基硅烷键合硅胶

　　极性：氨基和氰基硅烷键合相

　　(2)流动相

　　正相色谱：烷烃加极性调节剂

　　反相色谱：甲醇-水、乙腈-水

　　五、色谱系统适用性试验

　　固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变，其余可适当改变以达到色谱系统适用性试验要求

　　1.理论塔板数：不得低于各品种项下规定的最小理论塔板数

　　2.分离度：除另有规定外，分离度应大于1.5

　　3.重复性：取各品种项下对照品2连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差不大于2.0%

　　4.拖尾因子：除另有规定外，拖尾因子应在0.95～1.05之间

　　六、应用

　　1.鉴别：利用保留值进行鉴别。

　　2.检查

　　(1) 内标法加校正因子测定供试品中某个杂质含量

　　(2) 外标法测定供试品中某个杂质含量

　　(3) 加校正因子的主成分自身对照法

　　(4) 不加校正因子的主成分自身对照法

　　(5) 面积归一化法：一般不用于微量杂质检查

　　3.含量测定：外标法，内标法

　　内标物要求：①原样品中不含有的组分;②保留时间与待测组分相近，但能完全分离;③纯度合乎要求。

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