2013执业药师考试药物分析复习

　　第六章 色谱法

　　色谱法： 是分析混合物的最有效的手段。

　　应用范围：定性鉴别、纯度检查、含量测定。

　　第一节 色谱法基础

　　一、常用术语

　　1.色谱图和色谱峰

　　色谱峰：正常：正态分布曲线;不正常：拖尾峰和前延峰。用拖尾因子衡量。

　　每个组分的色谱峰可用三项参数说明

　　峰高或峰面积：用于定量。 峰宽W：用于衡量柱效

　　峰位：用保留值tR表示，用于定性。

　　2. 基线

　　色谱分离过程中，没有组分流出时的流出曲线。反映色谱系统(主要是检测器)噪音水平

　　3. 保留值：

　　保留时间( tR )、死时间( t0 )、 调整保留时间(tR´): tR´= tR - t0

　　相对保留值(r)：即选择性因子， r2,1= tR2´/ tR1´= k2/k1

　　4. )、半高峰宽( Wh/2)、峰宽(W)s色谱峰区域宽度：标准差(

　　二、基本理论

　　★ 1. 分配系数与色谱分离

　　色谱过程是物质分子在相对运动的两相(固定相和流动相)间分配平衡的过程， 混合物中，若两组分的分配系数(K )和容量因子(k)不等， ——差速迁移被分离。

　　(1)分配系数K：组分在固定相和流动相之间达到分配平衡时的浓度之比。

　　K = Cs/Cm (3)

　　K：与组分自身特性、固定相、流动相的性质及温度有关

　　色谱法分离依据：不同组分在固定相和流动相间K的差异 分离

　　(2)容量因子k (质量分配系数)：达分配平衡后，组分在固定相和流动相中的质量之比。

　　k = Ws/Wm (4)考试用书

　　k与K的关系：

　　k = Cs•Vs/(Cm•Vm )= K(Vs/Vm) (5)

　　k: 与组分、固定相、流动相的性质及温度有关;还与两相体积有关。

　　不同组分之间的 k 差异是色谱分离的先决条件

　　(3)色谱过程方程

　　tR=t0(1+K•VS/Vm)=t0(1+k) (6)

　　2. 塔板理论

　　色谱柱踏板数大于103时，流出曲线趋于正态分布。

　　理论踏板高(H)可由柱长(L)和理论踏板数 n 计算：

　　H = L /n n = 5.54 (tR/Wh/2)2 (7)

　　式中分子分母单位统一

　　H 和 n 都是柱效指标，可用于评价柱效高低。 塔板数越多，塔板高度越小，柱效越高

　　3. 速率理论

　　Van Deemter方程，范氏方程：H = A + B/u + Cu

　　A为涡流扩散项，B为纵向扩散系数，C为传质阻抗项

　　HPLC中范式方程简化为：

　　H = A + Cu (8)

　　影响液相色谱柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。

　　三、分类：

　　《中国药典》将色谱法分为纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、电泳法、毛细管电泳法及分子排阻色谱法等

　　1. 按分离原理分类：

　　吸附色谱法：固定相为固体(吸附剂)

　　分配色谱法：固定相为液体

　　离子交换色谱法：固定相为离子交换树脂

　　分子排阻色谱法(空间排组色谱法、凝胶色谱法)：固定相为多孔性填料(凝胶)

　　第二节 薄层色谱法 thin layer chromatography TLC

　　薄层色谱法 主要用于药品的鉴别或杂质检查。

　　按分离原理主要分为：吸附、分配和分子排阻色谱法。吸附薄层色谱法最常用。

　　吸附薄层色谱法分离依据：难被吸附化合物移动快 分离®KA≠KB®，产生差速迁移

　　一、仪器与材料

　　吸附TLC法固定相为吸附剂，最常用硅胶，其次有硅藻土、氧化铝、微晶纤维素、聚酰胺等。

　　硅胶：SiO2•xH2O， 具有硅氧交联结构、表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基是活性基团。含水量↑，活性↓

　　活化：105℃ ~ 110℃加热30 min，吸附力增强。

　　TLC常用硅胶G、硅胶GF254、硅胶H和硅胶HF254。

　　二、操作方法

　　1.薄层板的制备：涂布厚度0.2～0.3 mm。

　　2.点样与展开

　　点样的样点一般为圆点，点样基线距底边2.0cm;样点直径一般为2～4mm;展开时，薄层板浸入展开剂的深度为距薄层底边0.5～1.0cm。

　　三、色谱系统适用性试验

　　目的： 使斑点的检测灵敏度、比移值(Rf)和分离效能符合规定

　　1.检测灵敏度 被测物质能被检出的最低量

　　2.比移值(Rf)—— 基本定性参数 ：

　　Rf = l / lo (9)

　　Rf 最佳范围0.3～0.5;可用范围0.2～0.8。

　　分离效能 分离度(R)表示

　　R=2d /(W1+W2) (10)

　　四、应用：TLC法主要用于药品的鉴别或杂质检查。

　　(一)鉴别：

　　可认为供试品与对照品是同一物质。®¾供试品、对照品颜色与比移值Rf均一致®¾展开显色后®¾将同浓度的供试品溶液、对照品溶液点在同一薄层板上

　　(1)与对照品比较Rf值 (2)与结构相似的物质比较Rf值

　　(二) 杂质检查

　　1.杂质对照品法： 可认为未超过规定的杂质最高限量。®¾杂质斑点颜色与杂质对照品斑点比较，不得更深

　　2.自身稀释对照法(高低浓度对比法) 适用于得不到杂质对照品的情况

　　供试品溶液按限度规定稀释成另一低浓度溶液或系列溶液，为对照溶液。供试品杂质斑点与相应的自身稀释对照液所显主斑点比较，颜色不得更深.

　　第三节 高效液相色谱法

　　(high performance liquid chromatography HPLC)

　　HPLC法包括分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法和分子排阻色谱法。其中分配色谱法最常用。

　　高效液相分配色谱法又可分为正相分配色谱法和反相分配色谱法。

　　正相分配色谱法：流动相极性<固定相极性。

　　主要用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。

　　反相分配色谱法：流动相极性>固定相极性。主要用于分离非极性至中等极性物质。

　　一、HPLC仪器的基本结构

　　高压输液泵、色谱柱 、进样阀 (六通进样阀)、检测器和积分仪或色谱工作站。

　　二、检测器

　　(一) 选择性检测器：也称浓度型检测器，包括紫外检测器、光电二极管阵列检测器DAD 、荧光检测器、电化学检测器和质谱检测器。

　　(二) 通用型检测器：也称质量型检测器，包括示差折光检测器和蒸发光散射检测器(ELSD)。

　　ELSD 仅适用于UV检测困难的物质分析，如糖类和脂质等，以及药物杂质的确认。

　　如ChP用HPLC-ELSD法测定硫酸庆大霉素中C组分的含量。

　　三、固定相与流动相

　　(一) 固定相

　　HPLC最常用的固定相是化学健合相，分为非极性键合相和极性键合相。

　　(1)非极性健合相：十八烷基硅烷健合硅胶(ODS，C18)、辛基硅烷健合硅胶(C8)，ODS在反相HPLC中最为常用。

　　(2)极性健合相：常用氨基和氰基硅烷键合相，即可用于正相色谱法，也可用于反相色谱法。多用于正相HPLC。

　　(二) 流动相

　　药物分析中应用最多的HPLC法为反相分配色谱法，流动相首选甲醇-水系统(末端波长检测时首选乙腈-水系统)。

　　ODS为固定相时，流动相中有机溶剂比例通常应不低于5%。 流动相pH值应控制在2~8间。

　　分析强极性化合物常用离子抑制色谱法或离子对色谱法。

　　分离碱类常用离子对试剂为烷基磺酸(盐)， 酸类常用烷基季铵盐如磷酸四丁基铵等。 

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