2013执业药师考试药物分析复习

　　第三节 高效液相色谱法

　　(high performance liquid chromatography HPLC)

　　HPLC法包括分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法和分子排阻色谱法。其中分配色谱法最常用。

　　高效液相分配色谱法又可分为正相分配色谱法和反相分配色谱法。

　　正相分配色谱法：流动相极性<固定相极性。

　　主要用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。

　　反相分配色谱法：流动相极性>固定相极性。主要用于分离非极性至中等极性物质。

　　一、HPLC仪器的基本结构

　　高压输液泵、色谱柱 、进样阀 (六通进样阀)、检测器和积分仪或色谱工作站。

　　二、检测器

　　(一) 选择性检测器：也称浓度型检测器，包括紫外检测器、光电二极管阵列检测器DAD 、荧光检测器、电化学检测器和质谱检测器。

　　(二) 通用型检测器：也称质量型检测器，包括示差折光检测器和蒸发光散射检测器(ELSD)。

　　ELSD 仅适用于UV检测困难的物质分析，如糖类和脂质等，以及药物杂质的确认。

　　如ChP用HPLC-ELSD法测定硫酸庆大霉素中C组分的含量。

　　三、固定相与流动相

　　(一) 固定相

　　HPLC最常用的固定相是化学健合相，分为非极性键合相和极性键合相。

　　(1)非极性健合相：十八烷基硅烷健合硅胶(ODS，C18)、辛基硅烷健合硅胶(C8)，ODS在反相HPLC中最为常用。

　　(2)极性健合相：常用氨基和氰基硅烷键合相，即可用于正相色谱法，也可用于反相色谱法。多用于正相HPLC。

　　(二) 流动相

　　药物分析中应用最多的HPLC法为反相分配色谱法，流动相首选甲醇-水系统(末端波长检测时首选乙腈-水系统)。

　　ODS为固定相时，流动相中有机溶剂比例通常应不低于5%。 流动相pH值应控制在2~8间。

　　分析强极性化合物常用离子抑制色谱法或离子对色谱法。

　　分离碱类常用离子对试剂为烷基磺酸(盐)， 酸类常用烷基季铵盐如磷酸四丁基铵等。

　　四、色谱系统适用性试验

　　色谱系统适用性试验通常包括：理论踏板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。

　　在各品种项下规定的色谱条件下， 固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变。

　　(1)色谱柱的理论踏板数(n) n用于评价色谱柱的分离效能 应指明测定物质

　　n=16 (tR /W)2 或 n=5.54 (tR /Wh/2)2 (11)

　　tR，Wh/2统一单位

　　如测得n低于规定，应改变柱长或载体性能、重填色谱柱等以求达到。

　　(2)分离度 (R)

　　评价待测组分与相邻共存物或难分离物质间的分离程度，衡量色谱系统效能的关键指标，

　　R=2(tR2-tR1)/(W1+W2) 或 R=2(tR2-tR1)/[1.70(W1,h/2+W2,h/2)] (12)

　　1.5 ³R

　　-

　　(3)重复性：

　　①外标法时，对照品溶液连续进样5次，其峰面积测量值的 RSD ≤2.0%

　　②内标法时，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其RSD ≤2.0%

　　1.05之间~(4)拖尾因子(T)： T = W0.05h/2d1 T应在0.95

　　五、测定法

　　《中国药典》用HPLC杂质检查方法有5种

　　1)内标法

　　测定对照品和内标物质的峰面积或峰高，计算 wwwyaoq.net

　　校正因子( f ) =(As /Cs) / (AR/CR) (13)

　　含量 (Cx) = f • Ax / (AS /CS ) (14)

　　可避免样品前处理及进样体积误差对结果的影响。

　　2)外标法

　　含量 (Cx) = CR • (Ax / AR) (15)

　　3)加校正因子的主成分自身对照法：

　　需杂质对照品和待测成分对照品

　　测定时，对照溶液为供试品溶液的稀释溶液

　　4)不加校正因子的主成分自身对照法 无对照品

　　对照溶液为供试品溶液的稀释溶液，稀释程度应为：浓度与杂质限度相当。

　　5)面积归一化法

　　六、应用

　　(一)鉴别 供试液主峰的保留时间与对照液一致

　　(二)杂质检查 《中国药典》用HPLC杂质检查方法有5种

　　1)内标法

　　2)外标法

　　3)加校正因子的主成分自身对照法

　　4)不加校正因子的主成分自身对照法

　　5)面积归一化法

　　(三)含量测定

　　内标法 、外标法

　　对内标物质的要求：原供试品中不含有的组分;其保留时间与待测组分相近，但能完全分开。纯度符合要求。

　　第四节 气相色谱法

　　气相色谱法(gas chromatography，GC) 系采用气体流动相流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法;不适于难挥发和热稳定性差的物质的分析;

　　一、仪器的基本结构

　　气相色谱仪由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统等组成。

　　载气源 可用氦、氮、氢作载气，常用载气为氮气。

　　顶空进样：适宜于固体和液体样品中挥发性组分的分离和测定。

　　二、检测器

　　气相色谱检测器可分为浓度型检测器和质量型检测器。浓度型检测器有热导检测器、电子捕获检测器ECD

　　1.火焰离子化检测器(FID)

　　氢气为燃气，空气为助燃气。检测器温度应高于柱温，并不低于150℃®¾防水气凝结，(否则倒流)，通常为 250 ℃ - 350 ℃

　　2.电子捕获检测器(ECD) 主要用于含卤素药物

　　3.质谱检测器(MS) 能给出相应的结构信息

　　4.热导检测器 (TCD) 检测组分的浓度变化

　　三、常用固定液与载体

　　基于分配机制分离的气液色谱法(GLC)最为常用

　　(一)常用的固定液：

　　◆烃类：常用的角鲨烷(鲨鱼烷)是标准非极性固定液

　　◆硅氧烷类 ：应用最广的通用型固定液 ，主要有甲基硅氧烷(SE-30)和苯基硅氧烷(SE-52、OV-17、OV-25等)

　　◆醇类：聚乙二醇(如PEG-20M)是药物分析最常用的固定液之一

　　(二)载体(担体) 作用：承载固定液

　　为化学惰性的多孔性微粒，常用硅藻土型载体：分为红色载体和白色载体。

　　四、色谱系统适用性试验

　　在各品种项下规定色谱条件下，检测器种类、固定液品种及特殊指定的色谱材料不得改变。试验内容及要求同HPLC

　　五、测定法： 内标法、外标法、面积归一化法、标准溶液加入法

　　六、应用

　　(一)鉴别 供试液主峰的保留时间与对照品溶液一致

　　(二)杂质检查： 内标法、外标法、面积归一化法和标准溶液加入法

　　(三)在含量测定中的应用： 内标法、外标法和标准溶液加入法

　　第五节 电泳法

　　电泳法(electrophoresis) 是指带电荷的供试品在惰性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱并计算其含量(%)的方法。

　　一、基本原理

　　E (16)m v=

　　双电层与电渗：电泳所用的支持物(如滤纸)在溶液中带负电，而使接近其表面的缓冲液带正电，且形成双电层。在电场的作用下，带正电的缓冲液整体向负极移动，形成电渗。

　　电泳分离后各组分的相对位置由组分的电泳泳动和缓冲液的电渗共同决定的。

　　二、平板电泳法

　　(1) 纸电泳法

　　(2) 醋酸纤维素薄膜电泳法

　　(3) 琼脂糖凝胶电泳法

　　(4) 聚丙烯酰胺凝胶电泳法

　　(5) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定蛋白质分子量

　　三、毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)

　　以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分淌度和(或)分配行为上的差异而实现分离。

　　毛细管电泳的主要分离模式：

　　1.毛细管区带电泳(CZE)

　　2.毛细管凝胶电泳(CGE)

　　3.毛细管等速电泳(CITP)

　　4.毛细管等电聚焦电泳(CIEF)

　　5.胶束电动毛细管色谱 (MEKC或MECC)

　　6.毛细管电色谱(CEC)

　　四、应用

　　1.鉴别(主成分与对照品迁移率一致) ChP用琼脂糖凝胶电泳法对肝素钠乳膏进行鉴别

　　2.分子量测定：ChP用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对注射用重组人促红素分子量进行测定

　　3.纯度检查

　　4.等电点测定

　　5.分子组分比的测定 

　　2012年执业药师考试成绩查询入口汇总

　　2013年执业药师考试招生简章>>

　　 2012年执业中药师西药师深度解析>>
 

　　文都执业药师企业版微博隆重上线