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2014执业中药师中药化学辅导：中药有效成分的提取与分离3
2.利用两种以上不同溶剂的极性和溶解性差异进行分离
在溶液中加入另一种溶剂以改变混合物的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。
水提醇沉法：在药材浓缩的水提液中加入数倍量的乙醇稀释。(沉淀除去多糖、蛋白质等水溶性杂质。)
醇提水沉法：在药材浓缩的水提液中加入数倍量的乙醇稀释。(沉淀除去树脂、叶绿素等水不溶性杂质。)
另：醇/醚法、醇/丙酮法。(可使皂苷沉淀析出，而脂溶性的树脂等杂质留在母液中)
3.利用酸碱性(不同)进行分离
对酸性、碱性或两性有机化合物来说，加入酸、碱以调节溶液的pH，改变分子的存在状态，从而改变溶解度实现分离。
酸提碱沉：生物碱等碱性成分。
碱提酸沉：黄酮、蒽醌类等酸性成分。
内酯或内酰胺结构的成分可被皂化溶于水，借此与其他难溶于水的成分分离。
4.利用沉淀试剂进行分离
酸性或碱性化合物可通过加入某种沉淀试剂，使之生成水不溶性的盐类等沉淀析出。
酸性化合物 + 钙盐、钡盐、铅盐 → 沉淀 → H2S气体 → 纯品
碱性化合物 + 苦味酸盐、苦酮酸盐等(有机酸盐)→ 先加入无机酸，再碱化 → 纯品
磷钼酸盐、磷钨酸盐、雷氏铵盐等(无机酸盐)
(二)根据物质在两相溶剂中的分配比(分配系数)不同进行分离
常见的方法有简单的液-液萃取法和液-液分配色谱(LC或LLC)等。
液—液萃取法的原理：
1.分配系数K值
溶质在任意不相混溶的两溶剂中的分配系数K：
K=CU/CL
K：分配系数;CU：溶质在上相溶剂中的浓度;CL：溶质在下相溶剂中的浓度
(K在一定的温度及压力下为一常数)
例：假定A、B两种溶质用三氯甲烷及水进行分配，A、B均为1.0g，KA=10，KB=0.1，两相溶剂体积比VCHCl3/VH2O=1，则一次振摇分配平衡后：
水的密度小于三氯甲烷，故水为上相，三氯甲烷为下相
A：KA=CH20/CCHCl3=10
则90%以上的溶质A将分配到水中，不到10%分配到三氯甲烷中
B：KB=CH20/CCHCl3=0.1
则不到10%的溶质B将分配到水中，90%以上的分配到三氯甲烷中
2.分离因子
分离因子β表示分离的难易
β=KA/KB(注：KA﹥KB)
分离难易判定：
β≥100，仅作一次简单萃取就可实现基本分离(如上例);
100>β≥10，通常需萃取10～12次;
β≤2，需萃取100次以上;
β≌1,即KA/KB≌1，则无法分离
3.分配比与pH
以酸性物质(HA)为例，其在水中的解离平衡及解离常数K可用下式表示：
酸性越强，Ka越大，pKa值越小。
碱性越强，Ka越小，pKa值越大。
通常酚类化合物的pKa值一般为9.2～10.8，羧酸类化合物的pKa值约为5
若使该酸性物质完全解离，即使HA均转变为A-，则pH ≌ pKa+2
若使该酸性物质完全游离，即使A-均转变为HA，则pH ≌ pKa-2
(游离型极性小，易溶于小极性的有机溶剂;解离型极性大，易溶于水或亲水性有机溶剂)
①若pH﹤3(酸性条件)
酸性物质游离态(HA)，极性小
碱性物质则呈离状态(BH+)，极性大
②若pH﹥12(碱性条件)
酸性物质解离形式(A-)，极性大
碱性物质游离状态(B)，极性小
4.液-液萃取与纸色谱
5.液-液分配柱色谱
将两相中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上作为固定相，填充在色谱管中，然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂作为流动相来冲洗色谱柱。
常用载体：硅胶、硅藻土及纤维素粉等。
常用反相硅胶填料有：RP-2(-C2H5)、RP-8(-C8H17)、RP-18(-C18H37)
(1)正相色谱：固定性极性 > 流动相极性
被分离物质极性越大(亲水性越强)，越不易洗脱。
固定相：强极性溶剂，如水、缓冲溶液等。
流动相：弱极性有机溶剂，三氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇等。
适用物质：水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物。
(2)反相色谱：固定性极性 < 流动相极性
被分离物质极性越小(亲脂性越强)，越不易洗脱。
固定相：可用石蜡油。
流动相：水或甲醇等强极性溶剂适用物质：脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等。
(3)加压液相柱色谱(了解，不做重点掌握)
载体：多为颗粒直径较小、机械强度及比表面积均大的球形硅胶微粒，如Zipax类薄壳型或表面多孔型硅球以及Zorbax类全多孔硅胶微球。
快速色谱(flash chromatography，约2.02×105Pa)、低压液相色谱(LPLC，<5.05×105 Pa)、 中压液相色谱(MPLC，5.05×105～20.2×105Pa)及高压液相色谱(HPLC，>20.2×105Pa)等。
各种加压液相柱色谱的大体分离规模
(三)根据物质的吸附性差别进行分离
物理吸附：靠分子间力吸附。无选择性，吸附与解吸附过程可逆，快速。
如硅胶、氧化铝、活性炭吸附。
化学吸附：靠化学反应吸附。有选择性，吸附牢固，部分不可逆。
如碱性氧化铝吸附黄酮等酚酸性物质。
半化学吸附：介于物理吸附与化学吸附之间，力量较弱。
如聚酰胺对黄酮类、醌类等化合物之间的氢键吸附。
1.物理吸附规律——极性相似者易于吸附
硅胶、氧化铝为极性吸附剂，特点：
(1)对极性物质具有较强的亲和能力。故同为溶质，极性强者将被优先吸附。
(2)溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出越强的吸附能力;溶剂极性增强，则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱。
(3)溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加入极性较强的溶剂时，又可被后者置换洗脱下来。
活性炭因为是非极性吸附剂，故与硅胶、氧化铝相反，特点为：
(1)对非极性物质具有较强的亲和能力， 在水中对溶质表现出强的吸附能力。
(2)溶剂极性降低，则 活性炭对溶质的吸附能力也随之降低。故从活性炭上洗脱被吸附物质时，洗脱溶剂的洗脱能力将随溶剂极性的降低而增强。
2.极性及其强弱判断
所谓极性乃是一种抽象概念，用以表示分子中电荷不对称(assymmetry)的程度，并大体上与偶极矩(dipole moment)、极化度(polarizability)及介电常数(dielectrie constant)等概念相对应。
(1)化合物结构中官能团的极性强弱：
官能团的极性
(2)含官能团的种类、 数目及排列方式等综合因素对化合物极性的影响
①化合物中所含正电或负电等电性基团越多，极性越强(如氨基酸强极性)。
②化合物所含的极性基团数目越多，极性越强(葡萄糖极性强于鼠李糖)。
③所含极性基团相同时，非极性基团越多，极性越弱(如高级脂肪酸极性弱)。
④酸、碱及两性化合物，游离型极性弱，解离型极性强，存在状态可随pH改变。
(3)化合物极性与介电常数
化合物极性大体可依据介电常数(ε)的大小判断，ε越大，极性越强。
3.简单吸附法的应用
(1)用于化合物的精制：结晶与重结晶过程中加入活性炭脱色、脱臭。
注意：有时拟除去的色素不一定是亲脂性的，故活性炭脱色不一定总能收到良好的效果。一般须根据预试结果先判断色素的类型，再决定选用什么吸附剂处理为宜。
(2)用于化合物的浓缩：如活性炭吸附浓缩一叶萩碱。
4.吸附柱色谱法用于物质的分离
(1)吸附剂及用量
主要吸附剂：硅胶、氧化铝。
用量：一般为样品量的30～60倍。
样品极性较小、难以分离者，吸附剂用量可适当提高至样品量的l00～200倍。
规格：通常为100目左右。
如采用加压柱色谱，还可以采用更细的颗粒，或甚至直接采用薄层色谱用规格。
(2)拌样及装样
硅胶、氧化铝吸附柱色谱，应尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解样品，以利样品在吸附剂柱上形成狭窄的原始谱带。
如样品在所选装柱溶剂中不易溶解，则可将样品用少量极性稍大溶剂溶解后,再用少量吸附剂拌匀,并在60℃下加热挥尽溶剂，置P205真空干燥器中减压干燥、研粉后再小心铺在吸附剂柱上。
(3)洗脱
洗脱溶剂宜逐步增加，但跳跃不能太大。实践中多用混合溶剂，并通过巧妙调节比例以改变极性，达到梯度洗脱分离物质的目的。
注意：一般，混合溶剂中强极性溶剂的影响比较突出，故不可随意将极性差别很大的两种溶剂混合在一起使用。实验室中最常应用的混合溶剂组合如表所示：
吸附柱色谱常用混合洗脱溶剂
(4)添加溶剂的选择
分离酸性物质：选用硅胶(显酸性)，洗脱溶剂加入适量乙酸，防止拖尾。
分离碱性物质：选用氧化铝(显弱碱性)，洗脱溶剂加入适量氨、吡啶、二乙胺，防止拖尾。
(5)洗脱剂的选择与优化
通过薄层色谱法(TLC)进行筛选
一般TLC展开时使组分Rf值达到0.2～O.3的溶剂系统可选用为柱色谱分离该相应组分的最佳溶剂系统。
5.聚酰胺吸附色谱
基本原理：氢键吸附。
适用化合物类型：酚类、醌类、黄酮类。
(1)聚酰胺的性质及吸附原理
性质：
商品聚酰胺均为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、三氯甲烷及丙酮等常用有机溶剂。
对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰乙酸及甲酸。
聚酰胺色谱的分离机理：一般认为是“氢键吸附”，即聚酰胺的吸附作用是通过其酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。至于吸附强弱则取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。
氢键：氢原子与电负性的原子X共价结合时，共用的电子对强烈地偏向X的一边，使氢原子带有部分正电荷，能再与另一个电负性高而半径较小的原子Y结合，形成的X—H┅Y型的键。
X、Y为氧(O)、氮(N)、氟(F)等电负性较大，且半径较小的原子。
吸附强弱通常在含水溶剂中大致有下列规律：
①形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强
②成键位置对吸附力也有影响。易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附即相应减弱。如：
③分子中芳香化程度高者，则吸附性增强;反之，则减弱。如：
④洗脱溶剂的影响
洗脱能力由弱到强的顺序为：
水<甲醇或乙醇(浓度由低到高)<丙酮<稀氢氧化钠水溶液或氨水<甲酰胺<二甲基甲酰胺(DMF)<尿素水溶液
(2)聚酰胺色谱的应用
①对酚类、黄酮类等含酚羟基化合物可逆吸附，分离效果好，吸附容量大，适于制备分离。
②可用于生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其他极性与非极性化合物的分离。
③对鞣质的吸附特强，近乎不可逆，故用于植物粗提取物的脱鞣处理。
6.大孔吸附树脂
性质：一般为白色球形颗粒状，通常分为非极性和极性两类，对酸、碱均稳定。
优势：
①操作简便，树脂可再生;
②可重复操作，产品质量稳定，收率恒定;
③既能选择性吸附，又便于溶媒洗脱，且不受无机盐干扰;
④一般不用有机溶媒，既保持传统的中医理论用药特色，又最大限度的保留了其有效成分。
(1)吸附原理：
①选择性吸附(由于范德华引力或产生氢键的结果)
②分子筛性能(由其本身的多孔性网状结构决定)
(2)影响吸附的因素：
①大孔树脂本身的性质(比表面积、表面电性、极性、能否形成氢键等)。
②洗脱溶剂的性质(极性、酸碱性)。
③被分离化合物的性质(分子量、极性、能否形成氢键)。
注：大孔树脂的色谱行为具有反相的性质，被分离物质的极性越大，其Rf值越大，越容易洗脱。
(3)大孔吸附树脂的应用：
主要用于天然化合物的分离和富集
预处理方法：用高浓度乙醇湿法装柱，继续用乙醇在柱上流动清洗，不时检查流出的乙醇液，至流出的乙醇液与水混合不呈现白色乳浊现象，然后以大量的蒸馏水洗去乙醇即可。
(4)洗脱液的选择：
洗脱液可选择水、甲醇、乙醇、丙酮、不同浓度的酸碱液等。
一般方法如下：
①用适量水洗，洗下单糖、鞣质、低聚糖、多糖等极性物质，用薄层色谱检识，防止极性大的皂苷被洗下;
②7O%乙醇洗，洗脱液中主要为皂苷，但也含有酚性物质、糖类及少量黄酮，实验证明30%乙醇不会洗下大量的黄酮类化合物;
③3%～5%碱溶液洗，可洗下黄酮、有机酸、酚性物质和氨基酸;
④10%酸溶液洗，可洗下生物碱、氨基酸;
⑤丙酮洗，可洗下中性亲脂性成分
注：研究表明，对吸附量真正起作用的是体积比表面积，即每毫升湿树脂所具有的比表面积。
(5)大孔树脂应用的安全性问题：
规格影响中药提取液的质量
大孔吸附树脂规格内容包括：
名称、牌(型)号、结构(包括交联剂)、外观、极性，以及粒径范围、含水量、湿密度(真密度、视密度)、干密度(表观密度、骨架密度)、比表面、平均孔径、孔隙率、孔容等物理常数;
此外还有未聚合单体、交联剂、致孔剂等添加剂残留量限度等参数。
练习题
最佳选择题
大孔吸附树脂吸附的物质用水充分洗脱后，再用丙酮洗脱，被丙酮洗下的物质是
A.单糖
B.鞣质
C.多糖
D.中性亲脂性成分
E.氨基酸
【正确答案】D
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